聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。

原理——DNA的半保留復制

DNA 在進行復制的時候鏈間氫鍵斷裂，雙鏈解旋分開，每條鏈作為模板在其上合成互補鏈，經過一系列酶的作用生成兩個新的DNA分子。

PCR技術步驟

變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

在其上合成互補鏈，經過一系列酶的作用生成兩個新的DNA分子。

PCR模板

   PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫(yī)學標本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得制DNA，經酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。

PCR引物設計

    PCR引物設計PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

（1）引物設計的基本原則引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。引物內部不應出現互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

（2）引物設計軟件Primer Premier5.0 （自動搜索）vOligo6 （引物評價）vVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3 （在線服務）

dNTPs

    dNTPs（核苷酸）由四個基本核苷酸組成。

緩沖體系

    PCR buffer能夠為DNA聚合酶活性提供適宜的化學環(huán)境。緩沖液pH通常為8.0-9.5，一般使用Tris-HCl來調節(jié)。鎂離子作為DNA聚合酶活性的輔助因子，有助于聚合期間dNTP的結合。酶活性位點處的鎂離子可催化引物的3′-OH與dNTP的磷酸基團間形成磷酸二酯鍵。此外， Mg2+ 能夠穩(wěn)定磷酸鹽骨架上的負電荷，從而促進引物與DNA模板形成復合物。緩沖液的一個常見成分是來自KCl的鉀離子，其可促進引物的吸附。也可使用硫酸銨(NH4)2SO4 代替KCl。銨離子(NH4+) 具有去穩(wěn)定作用，尤其對于錯配引物-模板復合物堿基對之間的弱氫鍵，因此可增強反應特異性。

DNA聚合酶

DNA聚合酶是PCR的重要組成部分，它們能夠從單鏈DNA模板合成新的互補鏈。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即摻入核苷酸并使引物從按5'至3’方向延伸。

TaqDNA 聚合酶是從一種嗜熱細菌中分離出來的，Taq DNA 聚合酶具有極高的熱穩(wěn)定性，或許能夠承受 PCR 的熱變性步驟。Pfu DNA聚合酶是一種為大家所熟知的超耐熱酶，來自于水熱環(huán)境中的超嗜熱古細菌 Pyrococcus furiosus。在95°C下，Pfu聚合酶的穩(wěn)定性能比 Taq聚合酶高20倍。高保真DNA聚合酶：其校正活性基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正錯誤插入的核苷酸。DNA聚合酶上的核酸外切酶活性位點與其5′→ 3′聚合酶活性位點是分離的。當錯配的核苷酸插入聚合結構域，DNA合成將因不合適的堿基配對動力學而暫停。暫停期間，DNA聚合酶將切除錯配的核苷酸并用正確的核苷酸替換。

PCR實驗操作

在進行基因克隆或者載體構建的實驗中我們使用高保真DNA聚合酶

按照說明書準備高保真酶mix、DNA模板、引物、雙蒸水

查看引物單信息，核對引物濃度和Tm值

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